Одновременно определяют токсигенные свойства выделенной культуры, для чего используют феномен образования преципитата (флоккулята) при соединении токсина и антитоксина на плотных питательных средах. Антитоксическую сыворотку наносят на полоску фильтровальной бумаги, которую помещают в чашку Петри с питательной средой. Культуру наносят на чашку «бляшками» или линиями перпендикулярно к фильтровальной бумаге.
Флоккулят выпадает в виде белых линий («стрел», или «усов»), расходящихся от места посева в тех точках, где соотношения антигена и антител оптимальны. Стрелы преципитации можно наблюдать и при определении токсигенности в смешанной культуре. Хорошо выраженные линии преципитации появляются у большинства токсигенных штаммов через 24—48 час. Неспецифические линии преципитации (у токсигенных и нетоксигенных дифтерийных микробов), как правило, выражены слабо, имеют нечеткие контуры и появляются чаще через 48—72 час.
При получении культур, морфологически сходных с дифтерийной палочкой, ферментирующих глюкозу с синтезом кислоты, не ферментирующих сахарозу и образующих стрелы преципитации в среде для определения токсигенности, можно сделать заключение о выделении бактерий дифтерии.
Чтобы отличить дифтерийную палочку от дифтероидов, ставят пробу на цистиназу. Дифтерийные палочки ферментируют цистин с образованием сероводорода, который вступает в реакцию с уксуснокислым свинцом, в результате чего среда по ходу посева уколом окрашивается в черный цвет, а вокруг места укола образуется коричневое «облачко». Ложнодифтерийные палочки диагностируют по наличию уреазы, способной расщеплять мочевину с образованием аммиака и двуокиси углерода. Наличие уреазы выявляется при посеве на бульон с мочевиной.
Для идентификации выделенной культуры по антигенным свойствам используют реакцию агглютинации на стекле с политиновой агглютинирующей сывороткой, содержащей антитела к наиболее распространенным в данный период серологическим типам дифтерийной палочки. Монотиповые сыворотки (I, II, III, IV, VI) рекомендуется применять для определения серотипа выделенной культуры в очагах дифтерии с целью установления источника заболевания.